OZNACZANIE ZAWARTOŚCI FLAWONOIDÓW W KORZENIU LUKRECJI GŁADKIEJ


 

III. Część doświadczalna (1)

 

3. Materiał do badań

Badano korzeń lukrecji gładkiej – Glycyrrhizae radix.

Miejsce wytwarzania:

Herbapol Białystok S.A.

Ul. Składowa 3

15-399 Białystok

3.1. Oznaczanie wilgoci [34,35,36]

 

       Wykonanie oznaczenia:

W wysuszonych do stałej masy, naczynkach wagowych odważano ok.   5 g surowca z dokładnością ± 0.001 g, następnie suszono w suszarce w temp. 105°C do stałej masy. Naczynka przykrywano przykrywkami i przenoszono do eksykatora z chlorkiem wapnia w celu ostudzenia ich do temperatury pokojowej (ok. 30 min.).

Procentową zawartość wilgoci obliczano z różnicy mas przed i po suszeniu wg wzoru:

                                         (a – b) × 100

                             X =  ———————

a – c

 

gdzie:

a – masa naczynka wagowego z odważką przed suszeniem /g/;

b – masa naczynka wagowego z odważką po suszeniu /g/;

c – masa pustego naczynka wagowego /g/.

 

Procentową zawartość wilgoci podano w tabeli  I

 

Tabela I

Badana próba

Masa pustego naczynka wagowego

Odważka lukrecji / g /

Masa naczynka wagowego z odważką lukrecji

Zawartość wilgoci / % /

Średnia zawartość wilgoci / % /

przed suszeniem

po suszeniu

1.

41.4938

 5.0003

46.4941

46.0872

8.14

 

8.24

2.

33.4843

5.0001

38.4844

38.0804

8.08

3.

29.3096

5.0001

34.3097

33.8843

8.51

4.

36.8615

5.0001

41.8616

41.4456

8.32

5.

39.7239

4.9996

44.7235

44.3135

8.20

6.

31.5891

4.9998

36.5889

36.1794

8.19

 

 

3.2. Oznaczanie substancji  azotowych

 

3.2.1. Oznaczanie azotu ogólnego - metodą Kjeldahla [34,35,36]

 

Odczynniki:

· siarczan miedziowy uwodniony / cz. d. a. /;

· siarczan potasowy / cz. d. a. /;

· kwas siarkowy / d = 1.84 g/cm3 /;

· 33 % roztwór wodorotlenku sodowego;

· roztwór kwasu siarkowego, o stężeniu 0,05 mol/dm3;

·     wskaźnik Tashiro – o składzie: 10 cz. 0.02% roztworu czerwieni metylowej w 96% etanolu i 3 cz. 0.1% wodnego roztworu błękitu metylenowego;

·  roztwór wodorotlenku sodowego, o stęż. 0.1 mol/dm3.  

 

 

Wykonanie oznaczenia:

 

Przygotowano 6 odważek ( 2 po 0.3 g, 2 po 0.5 g, 2 po 0.6 g ) korzenia lukrecji. Do każdej kolby dodawano 0.5 g siarczanu miedziowego /CuSO4 . 5H2O/, 7.5 g siarczanu potasowego oraz 20 cm3 stężonego roztworu kwasu siarkowego /d = 1.84/. Całość spalano aż do uzyskania jasnozielonego klarownego roztworu, następnie ogrzewano jeszcze przez 2 godziny.                  Po ostudzeniu kolb Kjeldahla dodawano po 50 cm3 wody destylowanej,               a następnie taką ilość 33% roztworu wodorotlenku sodowego (aż do zbrunatnienia roztworu), aby zalkalizować zawartość kolb i destylowano z parą wodną do chwili, w której destylat nie wykazywał już odczynu alkalicznego. Destylat zbierano do kolb stożkowych z dokładnie odmierzoną ilością (20 cm3) roztworu kwasu siarkowego, o stęż. 0.05 mol/dm3, do których wcześniej  dodano 8 ¸ 10 kropli wskaźnika Tashiro. Nadmiar kwasu siarkowego odmiareczkowywano roztworem wodorotlenku sodowego o stęż. 0.1 mol/dm3.

1 cm3 roztworu kwasu siarkowego o stęż. 0.05 mol/dm3, odpowiada 0.0014 g azotu.

Zawartość azotu ogólnego obliczano wg wzorów:

 

c = (a ´ f ’) – (b ´ f ”)

 

                        c × 0.0014 × 100

X = ————————

                                 d

     

gdzie:

a  –  liczba cm3 roztworu H2SO4, o stęż. 0.05 mol/dm3, odmierzona do odbieralnika (a = 20 cm3);

f’     –  współczynnik roztworu H2SO4 (f’ =1.0375);

b –  liczba cm3 roztworu NaOH, o stęż. 0.1 mol/dm3, zużyta do odmiareczkowania nadmiaru H2SO4;

f” –  współczynnik roztworu NaOH (f” =1.0256);

c –  liczba cm3 roztworu H2SO4, o stęż. 0.05 mol/dm3, związana przez oddestylowany amoniak;

d –  odważka badanego surowca /g/

Otrzymane wyniki przedstawiono w tabeli II

Tabela II

Badana próbka

Odważka lukrecji /g/

Zawartość azotu ogólnego

Średnia zawartość azotu ogólnego g/100 g s.m.

g/100 g

g/100 g s.m.

1.

0.3004

2.24

2.44

 

2.25

2.

0.3005

1.90

2.07

3.

0.5000

1.88

2.05

 

2.01

4.

0.5000

1.82

1.98

5.

0.6005

1.78

1.94

 

1.94

6.

0.6004

1.79

1.95

 

 

 

3.2.2. Oznaczanie azotu związków niebiałkowych rozpuszczalnych w wodzie – wg Biełozierskiego i Proskuriakowa [37]

 

Zasada oznaczenia:

Metoda polega na wytrąceniu białek za pomocą 10% roztworu siarczanu miedziowego oraz 2.5% roztworu wodorotlenku sodowego. W osadzie, oprócz białek, znajduje się nierozpuszczalna chityna.

 

Odczynniki:

·          10% wodny roztwór siarczanu miedziowego /CuSO4 ∙ 5 H2O/;

·          2.5% wodny roztwór wodorotlenku sodowego.

 

        Wykonanie oznaczenia:

 

W naczynkach wagowych odważano po ok. 2 g sproszkowanego korzenia lukrecji i przenoszono do zlewek, popłakując naczynka 50 cm3 gorącej wody podwójnie destylowanej. Doprowadzano do wrzenia, a następnie dodawano 20 cm3 10% roztworu siarczanu miedziowego i 1 cm3 2.5% roztworu wodorotlenku sodowego. Po wymieszaniu bagietką, całość pozostawiano na 1 godzinę. Wytrącone białko i nierozpuszczalną chitynę odsączano, przemywając osady kilkakrotnie małymi porcjami gorącej wody podwójnie destylowanej. Otrzymane przesącze zagęszczano, następnie oznaczano zawartość azotu związków niebiałkowych rozpuszczalnych w wodzie za pomocą opisanej metody Kjeldahla.

Otrzymane wyniki przedstawiono w tabeli  III

 

Tabela III

 

Badana próbka

Odważka lukrecji /g/

Zawartość azotu związków niebiałkowych rozpuszczalnych w wodzie

Średnia zawartość azotu związków niebiałk. rozp. w wodzie g/100 g s.m.

g/100 g

g/100 g s.m.

1.

2.0007

0.486

0.530

0.53

2.

2.0047

0.485

0.529

3.

2.0371

0.478

0.521

4.

2.0098

0.484

0.527

5.

2.0175

0.472

0.514

6.

2.0002

0.486

0.530

 

 

 

3.2.3.  Oznaczanie   azotu   związków   niebiałkowych    nierozpuszczalnych   w wodzie /chityna/ [38,39]

 

        Zasada oznaczenia :

        Do oznaczania chityny zastosowano metodę kolorymetryczną, opisaną przez Więckowską i dostosowaną do badań produktów spożywczych.

Metoda ta polega na pośrednim oznaczeniu chityny za pomocą określenia zawartości chlorowodorku glukozoaminy - produktu kwaśnej hydrolizy chityny. Uzyskany po hydrolizie kwasem solnym chityny chlorowodorek glukozoaminy kondensuje się z acetyloacetonem w środowisku alkalicznym, a następnie przez działanie roztworem aldehydu                            p-dimetyloaminobenzoesowego w środowisku kwaśnym, powstaje związek barwny, który oznacza się kolorymetrycznie.

Odczynniki:

•  substancja wzorcowa: chlorowodorek glukozoaminy /cz. d. a./.

   Roztwór podstawowy przygotowano przez rozpuszczenie 0.5 g substancji wzorcowej w wodzie podwójnie destylowanej w kolbie miarowej  poj. 50 cm3. Roztwór roboczy przygotowano przez pobranie 1 cm3 roztworu podstawowego i uzupełnieniu do 100 cm3 wodą podwójnie destylowaną;

• odczynnik I: 2.4 cm3 acetyloacetonu w 120 cm3 roztworu węglanu sodowego o stęż. 2 mol/dm3;

•  odczynnik II: 1.6 g aldehydu p-dimetyloaminobenzoesowego w 120 cm3 stężonego roztworu kwasu solnego;

•  bezwodny etanol.

 

Wykonanie oznaczenia :

 

Do probówek kalibrowanych poj. 10 cm3 z doszlifowanym korkiem wprowadzano od 0.25 cm3 do 2 cm3 roboczego roztworu chlorowodorku glukozoaminy. Następnie dodawano 1 cm3 odczynnika I, ścianki probówek spłukiwano 1 – 2 cm3 wody podwójnie destylowanej (w zależności od tego, ile pobrano roztworu do badania) i ogrzewano zakorkowane probówki w czasie 30 min. we wrzącej łaźni wodnej. Jednocześnie do 6 innych probówek kalibrowanych o poj. 10 cm3 z doszlifowanym korkiem wprowadzano 2 cm3 hydrolizatu badanego korzenia i postępowano j.w. Po ostudzeniu do probówek dodawano 5 cm3 bezwodnego etanolu i 1 cm3 odczynnika II. Następnie zawartość probówek energicznie wstrząsano (wydzielał się dwutlenek węgla     – należało ostrożnie rozluźnić korki). Zakorkowane probówki termostatowano w łaźni wodnej w temp. 37°C przez 30 min., wstrząsając co pewien czas. Po wyjęciu z łaźni, probówki studzono i uzupełniano bezwodnym etanolem do objętości 10 cm3. Następnie próbki odstawiano na 1.5 godziny, po czym mierzono absorbancję roztworów badanych (wobec ślepej próby, przygotowanej równolegle), za pomocą spektrofotometru „SPECOL 11" przy długości   λ = 530 nm, w kiuwetach szklanych, o grub. warstwy 1 cm. Wykonano kilka serii pomiarów, na podstawie których wykreślono krzywą kalibracji.  

 

Parametry krzywej kalibracji do oznaczania chityny:

Stężenie (μg/cm3)

Pole tekstowe: r    = 0.997903
 
a    = 0.288632
 
b    = 0.019053
 
śr  = 0.013495
 
y   = 0.2886x + 0.0191
 
R2 = 0.9958

 

Absorbancja

 

0

0

0.25

0.09

0.5

0.175

0.75

0.238

1

0.317

1.25

0.395

1.5

0.45

2

0.58

Otrzymane wyniki pomiarów absorbancji przedstawiono w tabeli IV

 

  Tabela IV

 

Lp.

Liczba cm3 roztworu roboczego

Liczba cm3 wody podwójnie destylowanej

Stężenie chlorowodorku glukozoaminy [μg/cm3]

Absorbancja

Średnia wartość absorbancji

1.

0.25

1.75

2.50

0.092

0.090

0.088

0.090

2.

0.50

1.50

5.00

0.173

0.176

0.176

0.175

3.

0.75

1.25

7.50

0.239

0.240

0.235

0.238

4.

1.00

1.00

10.0

0.315

0.317

0.319

0.317

5.

1.25

0.75

12.5

0.394

0.398

0.393

0.395

6.

1.50

0.50

15.0

0.435

0.462

0.453

0.450

7.

2.00

0.00

20.0

0.597

0.573

0.570

0.580

 

 

 

 

 

Hydroliza surowca:

 

 

Do ampułek odważano ok. 50 mg sproszkowanego surowca i zalewano   2 cm3 stężonego roztworu kwasu solnego. Niezatopione ampułki pozostawiano na noc. Następnie dodawano po 2 cm3 wody podwójnie destylowanej, ampułki zatapiano i ogrzewano we wrzącej łaźni wodnej przez 12 godzin. Jest to czas potrzebny do całkowitej hydrolizy chityny. Po hydrolizie zawartość ampułek przenoszono do eksykatora pod zmniejszonym ciśnieniem w obecności pięciotlenku fosforu i wodorotlenku sodowego. Suchą pozostałość rozpuszczano  w niewielkiej ilości wody podwójnie destylowanej. Następnie sączono do kolbek miarowych i uzupełniano wodą destylowaną do objętości 50 cm3.

Do oznaczeń kolorymetrycznych pobierano 2 cm3 badanych roztworów i postępowano jak przy sporządzaniu krzywej kalibracji. Na podstawie uzyskanych wartości absorbancji (A = 0.001 ÷ 0.008) stwierdzono, że surowiec nie zawiera azotowych związków niebiałkowych nierozpuszczalnych w wodzie - chityny.

 

 

3.3. Oznaczanie zawartości substancji tłuszczowych - metodą Soxhleta [35]

 

Zasada oznaczenia :

 

Metoda polega na ekstrakcji tłuszczów z wysuszonego materiału rozpuszczalnikiem organicznym, oddestylowaniu rozpuszczalnika i wysuszeniu pozostałości, oraz na określeniu masy wyekstrahowanego „tłuszczu surowego".

Otrzymany w metodzie Soxhleta wyciąg nazywa się „tłuszczem surowym", ponieważ do wyciągu przechodzą z badanej substancji nie tylko tłuszcze właściwe, lecz również kwasy tłuszczowe, woski, fosfatydy, sterole, olejki lotne, niektóre witaminy, barwniki oraz inne związki rozpuszczalne w rozpuszczalnikach organicznych. 

 

Wykonanie oznaczenia:

 

Do gilz ekstrakcyjnych wykonanych z bibuły filtracyjnej, na dnie których umieszczano zwitek waty, odważano wysuszone próbki w ilości ok. 5 g. Przed zamknięciem gilz górną powierzchnię surowca nakrywano również watą. Kolby aparatu Soxhleta z kamykiem wrzennym suszono przed oznaczeniem  w celu uzyskania stałej masy. Następnie ważono z dokładnością ± 0.001 g.

W części ekstrakcyjnej aparatu Soxhleta umieszczano zamknięte gilzy. Do kolb wlewano rozpuszczalnik (eter naftowy) w takiej ilości, aby następowało samoczynne przeprowadzanie rozpuszczalnika lewarem do odbieralnika.

Ekstrakcję prowadzono 10-12 godz. Po jej zakończeniu kolby odłączano od aparatu, rozpuszczalnik oddestylowano, a pozostałość w kolbie suszono w temp. 100 - 105°C w czasie 1 godziny, po czym ważono z dokładnością ± 0.001 g.

Zawartość tłuszczu / T / obliczono według następującego wzoru:

 

           (b - a) x 100

T = ————————

                   c

 

gdzie: 

a – masa kolby z kamykiem wrzennym /g/;

b  – masa kolby z wyekstrahowanym tłuszczem po wysuszeniu do stałej masy /g/;

c – odważka badanej próby /g/.

 

Zawartość „tłuszczu surowego" w badanym korzeniu lukrecji przedstawiono w tabeli V

Tabela V

Lp.

Masa kolby z kamykiem wrzennym /a/

Masa kolby z wyekstr. tłuszczem po wysusz. do stałej masy

Odważka badanej próby

 

Masa wyekstr. tłuszczu

Średnia masa wyekstr. tłuszczu g/100 g s.m.    

g/100 g

g/100 g s.m.

1.

155.04

155.64

4.9998

12.00

13.08

13.36

2.

151.76

152.38

5.0024

12.39

13.50

3.

100.60

101.23

5.0001

12.59

13.72

4.

93.63

94.24

5.0002

12.19

13.28

5.

92.79

93.41

5.0004

12.40

13.51

6.

92.61

93.21

5.0002

12.00

13.08

               

 

3.4. Oznaczanie całkowitej zawartości węglowodanów

                          - metodą Bertranda [34,35]

 

Zasada oznaczenia:

W metodzie tej wykorzystuje się właściwości redukcyjne cukrów, związane z obecnością w ich cząsteczce grupy aldehydowej lub ketonowej.

 

Odczynniki:

• roztwór Bertranda I ( CuS04 × 5H2O);

• roztwór Bertranda II (NaKH4C4O6 × 4 H2O);

roztwór Bertranda III (Fe2/SO4/3 w H2SO4);

• roztwór nadmanganianu potasowego o stęż. 0.02 mol/dm3;

• 10% roztwór zasadowego octanu ołowiawego;

• 10% roztwór siarczanu sodowego;

• 2%    roztwór kwasu solnego ;

• 25% roztwór kwasu solnego.

 

Wykonanie oznaczenia:

 

Odważano ok. 5 g sproszkowanego korzenia lukrecji i dodawano 20 cm3     25% roztworu kwasu solnego i 100 cm3 wody destylowanej. Hydrolizę prowadzano we wrzącej łaźni wodnej, ogrzewając próbki pod chłodnicą zwrotną przez 8 godzin.

W hydrolizacie, po zobojętnieniu i usunięciu substancji balastowych oznaczano zawartość cukrów redukujących metodą Bertranda.

Do kolb miarowych poj. 250 cm3 przenoszono ilościowo otrzymane hydrolizaty, dodawano 70 cm3 10% zasadowego roztworu octanu ołowiawego. Nadmiar odczynnika zobojętniano 10% roztworem siarczanu sodowego. Roztwory uzupełniano wodą destylowaną do kreski i pozostawiano na 30 minut. Po tym czasie roztwory sączono do kolb Erlenmayera i w przesączach oznaczano cukry redukujące metodą Bertranda.

Do kolb Erlenmayera poj. 200 cm3 odmierzano za pomocą pipety 2.5 i 5 cm3 badanych roztworów i odpowiednio 17.5 i 15 cm3 wody destylowanej, dodawano po 20 cm3 roztworów: Bertranda I i Bertranda II. Kolby umieszczano na siatce i ogrzewano palnikiem do wrzenia, następnie utrzymywano roztwory w łagodnym wrzeniu dokładnie w ciągu 3 minut. Po ukończeniu ogrzewania kolby zdejmowano z siatki, umieszczano w ukośnym położeniu na 10 minut, a następnie dekantowano płyn znad wytrąconego tlenku miedzi - Cu (I) przez sączki ilościowe (o średnicy 9 cm) w ten sposób, aby jak najmniej osadu dostawało się na sączki. Osady na sączkach i w kolbie stale pozostawały pod warstwą wody, aby nie zachodziła reakcja utlenienia Cu (I)    do Cu (II). Sączki przemywano gorącą wodą do całkowitego usunięcia niebieskiej barwy, po czym umieszczano je w kolbach z tlenkiem miedzi Cu (I), rozpuszczonym w roztworze Bertranda III i dokładnie mieszano w celu rozpuszczenia tlenku miedzi Cu (I), znajdującego się na sączkach.

Otrzymane roztwory (po rozpuszczeniu osadów) miareczkowano natychmiast roztworem nadmanganianu potasowego, o stęż. 0.02 mol/dm3 do zabarwienia słabo różowego, utrzymującego się 15 sekund.

Z objętości nadmanganianu potasowego zużytego podczas miareczkowania obliczano w miligramach ilość zredukowanej podczas oznaczenia miedzi - wg wzoru:

 

Cu = 6.36 × a × f

gdzie:

a      – liczba cm3 roztworu KMnO4, o stęż. 0.02 mol/dm3, zużytego do

      miareczkowania;

f      – współczynnik roztworu KMnO4, o stęż. 0.02 mol/dm3 (f - 1.084);

6.36 – liczba mg Cu, odpowiadająca 1 cm3 roztworu KMnO4, o stęż. 0.02 mol/dm3.

 

Na podstawie obliczonej zawartości miedzi (w mg) odczytywano z tablic odpowiadającą jej liczbę mg cukru inwertowanego.

Zawartość cukrów obliczano uwzględniając rozcieńczenie badanej próbki.

Zawartość węglowodanów przedstawiono w tabeli VI.

 

Tabela VI

 

 

Lp.

Odważka lukrecji /g/

Liczba cm3 KMnO4 użytego do miareczkowania /cm3/

Liczba zredukowanej miedzi /mg/

Zawartość cukru inwertowanego mg/przesącz

Zawartość cukru inwertowanego g/100 g

Średnia zawartość węglowodanów

g/100 g

g/100 g s.m.

1.

5.0002

4.25*

29.30

14.35

28.70

28.27

30.81

2.

5.0002

4.15*

28.61

14.00

28.00

3.

5.0002

8.20**

56.53

28.55

28.55

4.

5.0002

8.00**

55.15

27.83

27.83

5.

5.0015

4.00*

27.58

13.50

27.00

28.23

30.76

6.

5.0015

3.95*

27.23

13.30

26.60

7.

5.0015

8.40**

57.91

29.29

29.29

8.

5.0015

8.60**

59.29

30.03

30.03

 

* - przy 2.5 cm3 pobranego przesączu

                  ** - przy 5 cm3 pobranego przesączu

 

 

3.5. Oznaczanie zawartości niektórych składników mineralnych   w korzeniu lukrecji metodą AAS [40,41]

 

3.5.1. Przebieg mineralizacji "na sucho" [36]

W celu oznaczenia niektórych makro- i mikroelementów przeprowadza­no mineralizację korzenia lukrecji oraz przygotowywano roztwory podstawowe.

Do wytrawionych kwasem azotowym (1+1) tygli kwarcowych odwa­żano ok. 5 g badanego surowca. Próbki spopie­lano, a następnie prażono w piecu elektrycznym w temp. 380 - 450°C.

Zmineralizowane próbki w postaci białego popiołu po ostudzeniu rozpuszczano w 5 cm3 roztworu kwasu azotowego o stęż. 0.1 mol/dm3. Tygle ogrzewano na wrzącej łaźni wodnej, aż do odparowania kwasu, a następnie popłukiwano je roztworem kwasu azotowego i przenoszono ilościowo do kolbek miarowych poj. 50 cm3. Zawartość kolbek uzupełnia­no do kreski kwasem  i sączono do suchych kolb. Równolegle przygoto­wywano próby odczynnikowe.                  

W otrzymanych mineralizatach oznaczano bezpośrednio poziom: żelaza, miedzi, manganu, cynku, wapnia, magnezu i kadmu. W przypadku wapnia i magnezu mineralizat rozcieńczano 1 : 250.

 

3.5.2. Wykonanie oznaczenia:

Stężenie metali w próbkach oznaczano za pomocą spektrofotometru absorpcji atomowej "Pye-Unicam SP-192". Warunki pracy aparatu przed­stawiono w tab. VII.

 Tabela VII

Pb

217.00

6

6

0.8 – 1.0

0.4 – 0.8

Ca

422.70

10

5

0.8 – 1.0

0.4 – 0.8

Fe

248.30

15

5

0.8 – 1.0

0.4 – 0.8

Cu

324.70

5

5

0.8 – 1.0

0.4 – 0.8

Mn

279.40

12

5

0.8 – 1.0

0.4 – 0.8

Mg

285.80

4

5

0.9 – 1.0

0.4 – 0.8

Cd

228.80

6

5

0.8 – 1.0

0.4 – 0.8

Zn

213.86

10

5

0.8 – 1.1

0.4 – 0.8

Parametry

Długość fali λ  (nm)

Prąd lampy max.(mA)

Przepływ powietrza (dm3/min.)

Przepływ acetylenu (dm3/min.)

Szczelina (nm)

Lp.

1.

2.

3.

4.

5.

 

 

 SPIS TREŚCI


Łódz, 2002

EMAIL

MAGISTER 2000 (c)