OZNACZANIE ZAWARTOŚCI FLAWONOIDÓW W KORZENIU LUKRECJI GŁADKIEJ


 

III. Część doświadczalna (2)

 

3.5.3. Przygotowanie krzywych kalibracji do oznaczania metali

• Roztwory podstawowe metali:

Do kolbek poj. 100 cm3 zawierających niewielką ilość wody i 1 cm3 stężonego roztworu kwasu solnego dodawano 1 cm3 roztworu wzorcowe­go każdego metalu (o stęż. 1 mg/cm3) i uzupełniano wodą; Otrzymano roztwory o stęż. 10 μg metalu/cm3.

• Roztwory kalibracyjne:

Do kolbek miarowych o poj. 50 cm3 zawierających niewielką ilość wody i 1 cm3 stężonego roztworu kwasu solnego dodawano: 0.25; 0.5; 1.0; 2.0; 3.0; 4.0; 5.0; 6.0; 7.5; 10.0 cm3 roztworu podstawowego każdego metalu i uzupełniano wodą podwójnie destylowaną. Otrzymane roz­twory odpowiadały stężeniom: 0.05; 0.1; 0.2; 0.4; 0.6; 0.8; 1.0; 1.2; 1.5; 2.0 μg metalu/cm3.

Zawartość metali obliczano z równań regresji.

Stężenie metali w badanym surowcu przedstawiono w tab. VIII, IX, X, XI, XII, XIII.

Oznaczenie zawartości żelaza

 

Stężenie (μg/cm3)

Absorbancja

Pole tekstowe: r    = 0.997638
 
a    = 0.020212
 
b    = 0.006858
 
śr   = 0.00466
 
y    = 0.0202x + 0.0069
 
R2 = 0.9953

 0.5

0.02

1

0.03

2

0.05

3

0.06

4

0.08

5

0.11

6

0.13

7.5

0.16

10

0.21

 

Tabela VIII

Lp.

Odważka lukrecji /g/

Absorbancja

Stężenie

Zawartość żelaza

μg/cm3

mg/50 cm3

mg/100 g

mg/100 g s.m.

Średnia mg/100 g s.m.

1.

5.1063

0.78

38.251

1.913

37.455

40.818

41.503

2.

5.1870

0.80

39.240

1.962

37.825

41.222

3.

5.2252

0.83

40.725

2.036

38.970

42.469

Oznaczenie zawartości miedzi

 

Stężenie (μg/cm3)

Absorbancja

Pole tekstowe: r    = 0.999105
 
a    = 0.09758
 
b    = 0.010488
 
śr   = 0.013836
 
y    = 0.0976x + 0.0105
 
R2 = 0.9982

 0.5

0.07

1

0.1

2

0.19

3

0.3

4

0.4

5

0.51

6

0.62

7.5

0.73

10

0.98

 

Tabela IX

Lp.

Odważka lukrecji /g/

Absorbancja

Stężenie

Zawartość miedzi

μg/cm3

μg/50 cm3

mg/100 g

mg/100 g s.m.

Średnia mg/100 g s.m.

1.

5.1063

0.55

5.529

276.45

5.414

5.900

6.182

2.

5.1870

0.58

5.836

291.80

5.626

6.131

3.

5.2252

0.62

   6.246

312.30

5.977

6.514

 

Oznaczenie zawartości manganu

 

Stężenie (μg/cm3)

Absorbancja

Pole tekstowe: r    = 0.998179
 
a    = 0.1038
 
b    = 0.029087
 
śr   = 0.021005
 
y    = 0.1038x + 0.0291
 
R2 = 0.9964

 0.5

0.06

1

0.12

2

0.26

3

0.37

4

0.45

5

0.55

6

0.62

7.5

0.81

10

1.07

Tabela X

Lp.

Odważka lukrecji /g/

Absorbancja

Stężenie

Zawartość manganu

μg/cm3

μg/50 cm3

mg/100 g

mg/100 g s.m.

Średnia mg/100 g s.m.

1.

5.1063

0.58

5.307

263.35

5.196

5.663

5.759

2.

5.1870

0.59

5.404

270.20

5.209

5.677

3.

5.2252

0.62

   6.693

334.65

6.404

5.937

 

Oznaczenie zawartości cynku

Stężenie (μg/cm3)

Absorbancja

Pole tekstowe: r    = 0.998635
 
a    = 0.101826
 
b    = 0.060977
 
śr   = 0.017837
 
y    = 0.1018x + 0.061
 
R2 = 0.9973

 0.5

0.11

1

0.16

2

0.27

3

0.35

4

0.46

5

0.58

6

0.71

7.5

0.81

10

1.07

Tabela XI

Lp.

Odważka lukrecji /g/

Absorbancja

Stężenie

Zawartość cynku

μg/cm3

μg/50 cm3

mg/100 g

mg/100 g s.m.

Średnia mg/100 g s.m.

1.

5.1063

0.90

8.240

412.00

8.068

8.792

9.091

2.

5.1870

0.96

8.829

441.45

8.511

9.275

3.

5.2252

0.96

   8.829

441.45

8.448

9.207

 

 

Oznaczenie zawartości wapnia

Stężenie (μg/cm3)

Absorbancja

Pole tekstowe: r    = 0.997842
 
a    = 0.118217
 
b    = – 0.02227
 
śr   = 0.02605
 
y    = 0.1182x – 0.0223
 
R2 = 0.9957

 0.5

0.05

1

0.1

2

0.22

3

0.34

4

0.46

5

0.55

6

0.64

7.5

0.85

10

1.2

 

Tabela XII

Lp.

Odważka lukrecji /g/

Absorbancja

Stężenie

Zawartość wapnia

μg/cm3

mg/odważkę

mg/100 g

mg/100 g s.m.

Średnia g/100 g s.m.

1.

5.1063

1.78

15.245

190.56

3731.91

4067.03

4.074

2.

5.1870

1.79

15.330

191.62

3694.33

4026.08

3.

5.2252

1.85

   15.838

197.97

3788.85

4129.09

 

Rozcieńczenie 1 : 250

 

Oznaczenie zawartości magnezu

Stężenie (μg/cm3)

Absorbancja

0

0

Pole tekstowe: r    = 0.998441
 
a    = 0.929931
 
b    = – 0.13907
 
śr   = 0.179707
 
y    = 0.9299x – 0.1391
 
R2 = 0.9968

 0.25

0.23

0.5

0.44

1

0.83

2

1.67

3

2.4

4

3.22

5

4.56

6

5.38

7.5

6.9

10

9,34

Tabela XIII

Lp.

Odważka lukrecji /g/

Absorbancja

Stężenie

Zawartość magnezu

μg/cm3

mg/odważkę

mg/100 g

mg/100 g s.m.

Średnia g/100 g s.m.

1.

5.1063

3.98

4.429

55.36

1084.20

1181.56

1.19

2.

5.1870

4.02

4.472

55.90

1077.69

1174.47

3.

5.2252

4.20

   4.666

58.32

1116.22

1216.46

 

Rozcieńczenie 1 : 250

 

W badanym surowcu nie stwierdzono obecności kadmu.

 

3.6. Oznaczenie zawartości flawonoidów w lukrecji gładkiej [15]

 

Flawonoidy oznaczano spektrofotometrycznie, po ich ekstracji z mieszaniny z zastosowaniem selektywnych rozpuszczalników (wyodrębnia się określone składniki z surowca). Ogólną zawartość flawonoidów (w % lub mg/g) przeliczano na hiperozyd lub kwercetynę, stosując odpowiedni przelicznik.

 

 

3.6.1. Wykonanie  oznaczenia

 

 

Przygotowanie roztworów podstawowych

Odważano dokładnie (podaną w monografii szczegółowej), masę średnio sproszkowanego (sito 0,315 mm) surowca do kolby okrągłodennej, dodawano 20 cm3 acetonu, 2 cm3 roztworu kwasu solnego (281g/l), 1 cm3 roztworu metenaminy (5 g/dm3) i utrzymywano przez 30 min. we wrzeniu pod chłodnicą zwrotną na łaźni wodnej. Hydrolizaty sączono przez watę do kolb miarowych poj. 100 cm3, osad wraz z watą umieszczano w kolbie, dodawano 20 cm3 acetonu i ponownie przez 10 min. utrzymywano we wrzeniu. Hydrolizę powtarzano jeszcze raz. Wyciągi sączono do tych samych kolb miarowych         i uzupełniano acetonem. Następnie odmierzano 20,0 cm3 roztworu do rozdzielacza, dodawano 20 cm3 wody i ekstrahowano octanem etylu, porcjami po 15 cm3 i 3 razy po 10 cm3. Połączone warstwy organiczne przemywano dwukrotnie wodą (po 40 cm3), sączono do kolb miarowych poj. 50 cm i uzupełniano octanem etylu.

       Przygotowanie roztworów do badań

 

Do oznaczeń przygotowano dwie próbówki. Do 10,0 cm3 roztworu podstawowego dodawano 2 cm3 roztworu chlorku glinu (20 g/dm3) i uzupełniano mieszaniną (1: 19) kwasu octowego (1,02 kg/dm3) z metanolem do 25,0 cm3.

 

       Przygotowanie roztworu porównawczego

10,0 cm3 roztworu podstawowego uzupełniano mieszaniną (1 : 19) kwasu octowego (1,02 kg/dm3) z metonolem do 25,0 cm3. Po 30 min. mierzono absorbancję roztworów przy 425 nm, stosując jako odnośnik roztwór porównawczy.

Zawartość flawonoidów obliczano (w % i w mg/g) w przeliczeniu na hiperozyd lub kwercetynę, zgodnie z wymogami monografii szczegółowej, wg wzoru:

           A · k

X = —————

              m

 

gdzie:

A – absorbancja roztworu badanego;

k  – przelicznik:

dla hiperozydu k = 1,25 (a 1%1cm = 500), jeżeli wynik w % lub          k = 12,5 jeżeli w mg/g;

  dla kwercetyny k = 0,875 (a 1%1cm = 714), jeżeli wynik w % lub       k = 8,75 jeżeli w mg/g;

m – odważka surowca w g.

 

Uzyskane wyniki zestawiono w tabeli XIV

 

Tabela XIV

Lp.

Odważka lukrecji /g/

Absorban-cja r-ru badanego λ=425 nm

Zawartość flawonoidów w przeliczeniu na hiperozyd

Zawartość flawonoidów w przeliczeniu na kwercetynę

mg/g

Średnia mg/g

%

mg/g

Średnia mg/g

%

1.

1.0040

0.181

0.180

0.180

0.182

2.26

2.25

2.25

2.27

2.257

0.23

0.23

0.22

0.23

1.58

1.57

1.57

1.59

1.577

0.16

0.16

0.16

0.16

2.

1.0000

0.191

0.192

0.191

0.192

2.39

2.40

2.39

2.40

2.395

0.24

0.24

0.24

0.24

1.67

1.68

1.67

1.68

1.675

0.17

0.17

0.17

0.17

3.

0.9008

0.170

0.174

0.172

0.172

2.36

2.41

2.39

2.39

2.387

0.24

0.24

0.24

0.24

1.65

1.69

1.67

1.67

1.670

0.16

0.17

0.17

0.17

4.

0.9019

0.172

0.169

0.167

0.170

2.38

2.34

2.31

2.36

2.347

0.24

0.23

0.23

0.24

1.67

1.64

1.62

1.65

1.645

0.17

0.16

0.16

0.16

5.

0.7995

0.156

0.158

0.156

0.157

2.44

2.47

2.44

2.45

2.450

0.24

0.25

0.24

0.24

1.70

1.73

1.70

1.72

1.712

0.17

0.17

0.17

0.17

6.

0.8020

0.154

0.155

0.155

0.157

2.40

2.42

2.42

2.45

2.422

0.24

0.24

0.24

0.24

1.68

1.69

1.69

1.71

1.692

0.17

0.17

0.17

0.17

 

3.7. Identyfikacja flawonoidów [14]

 

3.7.1. Przygotowywanie wyciągów z korzenia lukrecji

 

Wyciąg metanolowy podstawowy

 

 W kolbie okrągłodennej poj. 50 cm3 umieszczano 1.0 g surowca, zalewano 25 cm3 metanolu i ogrzewano pod chłodnicą zwrotną na łaźni wodnej przez 30 min. Wyciąg odsączano przez karbowany sączek, surowiec przenoszono do kolby i ponownie ekstrahowano metanolem /2 × 25 cm3/. Połaczone wyciągi zagęszczano na wyparce rotacyjnej do obj. 5 – 10 cm3.

 

Wyciąg metanolowy oczyszczony

 

a)      przygotowywany przez oczyszczanie gorącą wodą

 

Podstawowy wyciąg metanolowy odparowywano do sucha na wyparce rotacyjnej. Pozostałość zalewano 25 – 50 cm3 gorącej wody i ogrzewano na łaźni wodnej przez 15 minut, po ochłodzeniu pozostawiano w chłodziarce na 24 godziny. Następnie sączono płyn przez karbowany sączek, osad przemywano małą porcją ciepłej wody. Przesącz wodny ekstrahowano octanem etylu            (3 × 25 cm3). Połączone wyciągi octanowe zagęszczano do obj. 5 – 10 cm3.

 

b)      przez wstępne wytrawienie surowca chloroformem

 

W aparacie Soxhleta umieszczano 1.0 g surowca w gilzie z bibuły
i wytrawiano chloroformem, aż do uzyskania bezbarwnego wyciągu (ok. 8 – 10 godzin). Surowiec suszono pod wyciągiem, następnie przenoszono do kolby okrągłodennej i wytrawiano metanolem w sposób podany wyżej.

 

Wyciąg metanolowy po hydrolizie

 

Do kolby okrągłodennej poj. 50 cm3 przenoszono 5 cm3 podstawowego wyciągu metanolowego i odparowywano metanol /wyparka rotacyjna/. Pozostałość rozpuszczano w 20 cm3 gorącej wody, po ochłodzeniu dodawano    5 cm3 10% roztworu kwasu siarkowego i ogrzewano na łaźni wodnej pod chłodnicą zwrotną przez 3 godzinny. Po ochłodzeniu zawartość kolby przenoszono do rozdzielacza i ekstrahowano porcjami /5 × 20 cm3/ eteru etylowego, aż do uzyskania bezbarwnego wyciągu. Połączone wyciągi przemywano niewielką ilością wody, osuszano bezwodnym siarczanem sodowym. Następnie oddestylowywano rozpuszczalnik, a pozostałość rozpuszczano w 5 cm3 metanolu.

 

3.7.2.  Reakcje barwne charakterystyczne dla flawonoidów

 

Próba Shinody

 

Do 1 cm3 oczyszczonego wyciągu metanolowego z surowca dodawano niewielką ilość opiłek magnezu, po czym kroplami stężony kwas solny
i obserwowano powstałe zabarwienia.

W wyniku redukcji flawonoidów wodorem in statu nascendi powsta-wało zabarwienie pomarańczowe charakterystyczne dla flawonów.
Nie zaobserwowano natomiast zabarwienia malinowoczerwonego, charakterystycznego dla flawonoli i fioletowoczerwonego dla flawononów.
W przypadku chalkonów i auronów nie obserwujemy barwnych związków.

W reakcji Shinody zespół flawonoidów w wyciągach z surowców farmakopealnych, ze względu na przewagę związków typu flawonoli, daje zabarwienie różowe, malinowe do czerwonego.

Reakcja z chlorkiem glinu

 

Do 1 cm3 oczyszczonego wyciągu metanowego z surowca dodawano 5 kropli 2% metanolowego roztworu chlorku glinowego i obserwowano powstałe zabarwienie w świetle dziennym i UV.

Flawonoidy dawały z odczynnikem żółte lub zielonkawożółte kompleksy barwne, które w świetle UV wykazywały zielonożółtą fluorescencję. Reakcją tą można odróżnić chalkony, które z odczynnikiem tworzyłyby pomarańczowoczerwone kompleksy.

 

Reakcja z chlorkiem żelaza

 

Do 1 cm3 oczyszczonego wyciągu metanolowego z surowca dodawano       2 – 3 krople 2% metanolowego roztworu chlorku żelazowego i obserwowano powstałe zabarwienia.

Flawonoidy tworzyły z odczynnikiem kompleksy barwy zielonej. Reakcja ta jest mało specyficzna, ponieważ barwną reakcję z odczynnikiem dają inne związki o charakterze fenoli, np. garbniki.

 

Reakcja z kwasem borowym

 

W parownicy porcelanowej umieszczano 2 cm3 wyciągu
i odparowywano do sucha na łaźni wodnej. Do pozostałości dodawano 3 cm3
3% wodnego roztworu kwasu borowego i 1 cm3 10% wodnego roztworu kwasu szczawiowego, ponownie odparowywano do sucha na łaźni wodnej. Otrzymaną pozostałość wyekstrahowano 10 cm3 eteru. W obecności flawonoidów roztwór eterowy wykazywał żółtozieloną fluorescencję.

 

Reakcja z octanem magnezu

 

Do 1 cm3 oczyszczonego roztworu metanolowego z surowca
dodawano 2 – 3 krople 1%  roztworu octanu magnezu (roztwór metanolowy)
i obserwowano zachodzące reakcje barwne.

Powstał kompleks o zabarwieniu żółtym, wykazujący w świetle UV delikatną błękitną fluorescencję. Świadczyło to o obecności flawonów (żółte zabarwienie), oraz niewielkiej ilości flawanonów (słabo intensywna fluorescencja).

 

3.7.3. Analiza chromatograficzna flawonoidów

 

Roztwory wzorcowych glikozydów: 0,01% metanolowe roztwory 7-glukozydu apigeniny i 7-glukozydu luteoliny.

Roztwory wzorcowych aglikonów: 0,01% metanolowe roztwory apigeniny i luteoliny.

 

Chromatografia bibułowa dwukierunkowa

Specyfikacja:

 

Bibuła Whatman nr 1, kwadraty o boku 33 cm;

       faza ruchoma: 1 kierunek n-butanol – kwas octowy lodowaty   – woda /4 : 1 : 5/

       faza organiczna: 2 kierunek 15% kwas octowy.

 

Wyznaczano punkt startowy w lewym dolnym rogu bibuły w odległości 3 cm od każdego brzegu. Nakraplano badany wyciąg w ilości 50 mm3. Roztwory wzorcowe, wybrane do analizy na podstawie składu chemicznego badanego surowca, nakraplano w ilości 0,05 cm3 w dwóch przeciwległych punktach. Chromatogram rozwijano techniką wstępującą, w pierwszym kierunku 14-16 godzin, a następnie  po wysuszeniu bibuły i obróceniu arkusza
o 90˚, w drugim kierunku przez 4-5 godzin.

Chromatogramy analizowano w świetle UV przed i po wywołaniu          1% metanolowym roztworem chlorku glinowego. Następnie porównano wartości Rf i charakterystyczny układ plam na chromatogramach:

Chromatogram I – faza Partridgea (1 kierunek):

1        plamka; Rf = 0.71

2        plamka; Rf = 0.60

3        plamka; Rf = 0.37

4        plamka; Rf = 0.70 (wzorzec aglikonu apigeniny)

5        plamka; Rf = 0.39 (wzorzec 7-glukozydu apigeniny)

Chromatogram I – 15% kwas octowy (2 kierunek):

1        plamka; Rf = 0.28

2        plamka; Rf = 0.36

3        plamka; Rf = 0.54

4        plamka; Rf = 0.27 (wzorzec aglikonu apigeniny)

5        plamka; Rf = 0.52 (wzorzec 7-glukozydu apigeniny) 

Chromatogram II – faza Partridgea (1 kierunek):

1        plamka; Rf = 0.64

2        plamka; Rf = 0.57

3        plamka; Rf = 0.36

4        plamka; Rf = 0.67 (wzorzec aglikonu luteoliny)

5        plamka; Rf = 0.38 (wzorzec 7-glukozydu luteoliny)

Chromatogram II – 15% kwas octowy (2 kierunek):

1        plamka; Rf = 0.25

2        plamka; Rf = 0.35

3        plamka; Rf = 0.52

4        plamka; Rf = 0.26 (wzorzec aglikonu luteoliny)

5        plamka; Rf = 0.52 (wzorzec 7-glukozydu luteoliny)

Chromatogram III – faza Partridgea (1 kierunek):

1        plamka; Rf = 0.69

2        plamka; Rf = 0.60

3        plamka; Rf = 0.35

4        plamka; Rf = 0.70 (wzorzec aglikonu apigeniny)

5        plamka; Rf = 0.35 (wzorzec 7-glukozydu apigeniny)

Chromatogram III – 15% kwas octowy (2 kierunek):

1        plamka; Rf = 0.29

2        plamka; Rf = 0.39

3        plamka; Rf = 0.56

4        plamka; Rf = 0.28 (wzorzec aglikonu apigeniny)

5        plamka; Rf = 0.55 (wzorzec 7-glukozydu apigeniny) 

 

Rf dla wzorca 7-glukozydu apigeniny wynosi 0.68 ÷ 0.72 [42].

 

 SPIS TREŚCI


Łódz, 2002

EMAIL

MAGISTER 2000 (c)