OZNACZANIE ZAWARTOŚCI FLAWONOIDÓW W KORZENIU LUKRECJI GŁADKIEJ


 

I. Część  ogólna (2)

                       

1.3.12. Biflawonoidy

 

Połączenia dimeryczne flawonów, reprezentowane przez dwa typy budowy:

1) typ arylowy ginkgetyny, w którym połączenie dwóch cząsteczek           flawonu następuje pomiędzy atomami węgla pierścieni aromatycznych.

2) typ aryloeterowy hinikiflawonu, w którym połączenie to następuje przez atom tlenu.

Występują głównie u nagozalążkowych (Gymnospermae) w klasach Cycadopsida i Coniferopsida.

Wykazują wpływ na krążenie wieńcowe, podobnie jak dimeryczne proantocyjanidyny. Wchodzą w skład preparatów flawonowych, m.in. z Ginkgo biloba (Ginkgoaceae).

Najbardziej rozpowszechnionymi związkami są: amentoflawon, bilobetyna  i ginkgetyna. Typ aryloeterowy występuje stosunkowo rzadko [2].

 

    1.3.13. Chalkony

 

Podstawowy szkielet chalkonów nie ma środkowego układu heterocyklicznego. Szkielet ten jest izomeryczny w stosunku do flawonów. Chalkony stanowią formę nietrwałą, znajdującą się w równowadze z flawonami. Występują stosunkowo rzadko w świecie roślinnym, zwykle obok flawanonów (naryngeniny, hesperetyny), m.in. w rodzaju Helichrysum, Dahlia (Asteraceae), Glycyrrhiza (Fabaceae), Salix (Salicaceae).

W biosyntezie flawonoidów odgrywają ważną rolę jako produkt pośredni poprzedzający zamknięcie pierścienia pironowego. Chalkony są związkami lipofilnymi, żółto zabarwionymi. W zależności od struktury ekstrahują się rozpuszczalnikami organicznymi mniej lub więcej polarnymi. Występują też w postaci glikozydów, np. w kwiatostanach Carthamnus tinctorius (Asteraceae)    i w kwiatostanach kocanek piaskowych Helichrysum arenarium (Asteraceae). Dihydropochodne chalkonów w postaci glikozydów, otrzymywane z flawonów Citrus sp. są ponad 1000-krotnie słodsze od sacharozy.

1. Izosalipurpozyd — jeden z głównych flawonoidów występujących w kwiatostanach kocanek piaskowych Helichrysum arenarium, Asteraceae (Inflorescentia Helichrysi). Ma działanie spazmolityczne (słabsze od papa-weryny).

2. Ksantohumnol — występuje w zespole związków flawonowych chmielu Humulus lupulus (Moraceae).

3. Izolikwirytozyd — żółto zabarwiony glikozydowy składnik korzeni lukrecji Radix Glycyrrhizae, którego aglukonem jest izolikwirytygenina — o działaniu silnie spazmolitycznym, zbliżonym do działania papaweryny [2,3,14].

 

    1.3.14. Glikozydoestry flawonoidowe

 

Ostatnio wyodrębniono wiele połączeń flawonoidowych o charakterze glikozydoestrów z kwasami fenolowymi.

Tylirozyd — wyodrębniony z liści i kwiatów lipy Tilia argentea i Tilia cordata (Tiliaceae) — ma strukturę 3-p-kumaroilo-glukozydu kemferolu.            W skład  jego wchodzi jedna cząsteczka kwasu p-kumarowego. Ma właściwości przeciwzapalne. Podobne związki izolowano również z różnych gatunków mięty Mentha sp. (Lamiaceae), posłonka Helianthemum ovatum (Cistaceae) i in. W skład tych związków wchodzi m.in. kwas kawowy, p-kumarowy. Związki analogiczne znaleziono również wśród antocyjanów [2].

 

 

1.3.15. Flawonolignany

 

Jest to grupa substancji roślinnych odkrytych w owocach ostropestu plamistego Sylibum marianum (Asteraceae), określana jako zespół sylimaryny (aktywny kompleks flawonolignanów). Strukturalnie substancje te przedstawiają połączenia fragmentu 3-hydroksyflawonu taksyfoliny z alkoholem koniferylowym, jest to typ połączenia znany przy tworzeniu się lignanów, stąd substancje tej grupy określane są jako flawonolignany.

Sylibina jest przedstawicielem tej grupy, występuje w dwóch formach izomerycznych A i B w stosunku 1:1; kompleks ten zwany jest sylibininą. Obok niej występują związki izomeryczne izosylibina, sylidionina, sylichrystyna i in., różniące się konfiguracją przyłączenia alkoholu koniferylowego do cząsteczki taksyfoliny.

Sylibina wykazuje działanie antyhepatotoksyczne, przeciwdziała toksycznemu działaniu toksyn grzybowych uszkadzających wątrobę: a-amanity-ny, faloidyny, a także czterochlorku węgla i in. Uszczelnia błony komórkowe wątroby, utrudniając przenikanie tych toksyn. Znaczna ilość sylibiny gromadzi się w drogach żółciowych, co wiąże się z wewnątrzwątrobowym krążeniem tego związku.

Wpływa regenerujące na uszkodzone komórki wątroby. Poznano molekular­ny mechanizm tego procesu. Polega on na stymulacji jądrowej polimerazy I z RNA, co wzmaga wytwarzanie rybosomów i biosyntezę białka.

Sylibina ponadto hamuje utlenianie lipidów i biosyntezę prostaglandyn, przez co wywiera pewien efekt przeciwzapalny. Resorbuje się z przewodu pokarmowego w 20-50% i w stosowanych dawkach jest zupełnie nietoksyczna, podobnie jak cały zespół sylimaryny. Jako działanie niepożądane pojawia się czasem słaby efekt przeczyszczający.

Sylibina jest trudno rozpuszczalna w wodzie. Ostatnio uzyskano jej pochodne lepiej rozpuszczalne i lepiej wchłaniające się; podobne prace podjęto w Polsce nad rozpuszczalnymi pochodnymi sylidioniny [2,3].

      Właściwości farmakologiczne i lecznicze

Flawonolignany grupy sylimaryny, głównie sylibina, mają działanie antyhepatotoksyczne, ochronne dla wątroby. Właściwości te zostały eksperymen­talnie potwierdzone. W szczególności zostało stwierdzone antagonistyczne działanie sylimaryny w stosunku do toksyn muchomora sromotnikowego Amanita phalloides: falotoksyn i amatotoksyn. Wczesne          (do 48 godz.) za­stosowanie infuzji rozpuszczalnych pochodnych sylibiny może zapobiec śmier­telnemu zatruciu.

Właściwości sylibiny i innych towarzyszących jej flawonolignanów zawartych w preparatach kompleksowych znalazły zastosowanie w profilaktyce i terapii chorób wątroby (chroniczne zapalenia, marskość), dla jej ochrony przed wpływem toksyn, a także silnie działających leków (np. cytostatyków).

W tych celach stosowane są różne preparaty kompleksowe sylimaryny, nieraz z dodatkiem innych związków wspomagających lub mających działanie żółciopędne, którego sylimaryna nie wykazuje [2,3].

 

   Ważniejsze preparaty sylimaryny:

a) zawierające kompleks flawonolignanów:

Sylimarol         — tabl., zawiesina.

Sylimarosan    — alkoholowo-wodny wyciąg z nasion ostropestu.

Legalon           — tabl., krople.

Legalon SIL    — dihemibursztynian disodowy sylibiny do stosowania w postaci infuzji dożylnych.

b) zawierające sylimarynę z dodatkiem innych leków roślinnych:

Sylicinar      —    sylimaryna + wyciąg z karczochów (w Polsce próby zastosowa­nia w przewlekłym zapaleniu trzustki).

Syligran       —    granulat zawierający wyciąg z ostropestu + koszyczek rumianku, kwiat nagietka, liść brzozy, korzeń łopianu i ziele glistnika.

Artecholina —    wyciąg płynny z owoców ostropestu + ziele bożego drzewka, ziele drapacza, ziele krwawnika, ziele mięty pieprzowej, korzeń mniszka, ziele glistnika (dodatek wyciągów o działaniu żółciopędnym                  i żółciotwórczym).

c) preparaty kompleksowe:

Sylipid  —   połączenie sylibiny z fosfatydylocholiną (lepiej wchłanialne) [2].

 

       1.3.16. Leukoantocyjanidyny

Związki te stanowią jakby grupę pośrednią między flawonoidami, a antocyjanami; zwane są też proantocyjanami. Podstawowy szkielet ma charakter diolu (flawandiolu). Często występują w postaci dimerycznej albo polimerycznej i wtedy mają charakter protogarbników. Leukoantocyjanidyny są substancjami bezbarw­nymi. Pod wpływem kwasów przechodzą w barwne antocyjanidyny (na tej reakcji polega wykrywanie obecności leukoantocyjanidyn). Biochemicznie również związane są z katechinami, które powstają zazwyczaj przy kwaśnej hydrolizie dimerycznych lub oligomerycznych leukoantocyjanidyn. Leukoantocyjanidyny — szczególnie w postaci dimerycznej — są dość rozpowszechnione i występują w owocach, nasionach, czasem korze i drewnie.

Ich właściwości farmakologiczne i znaczenie jako ewentualnych substancji czynnych nie zostały dokładnie poznane, jakkolwiek istnieją dane wskazujące na kardiotoniczne działanie oligomerycznych leukoantocyjanidyn (procyjanidyn), np. z owoców głogu Crataegus oxyacantha (Rosaceae), a także na ich działanie zbliżone do działania witaminy P. Polimeryczne proantocyjanidyny mają działanie ściągające tym silniejsze, im wyższy jest stopień polimeryzacji [2].

 

       1.3.17. Antocyjany

 

Ta grupa obejmuje wielofenolowe barwniki roślinne: czerwone, niebieskie lub fioletowe, o charakterze glikozydowym, dlatego też są często określane jako antocyjanozydy.

Pod względem biochemicznym związane są one z flawonoidami, do których zresztą są zaliczane przez niektórych autorów. Są one również związane z leukoantocyjanidynami oraz katechinami — jako pochodne flawanu.

Część aglikonowa jest zwana antocyjanidyną, część cukrowa jest złożona z 1-3 cząsteczek cukrów prostych. Antocyjanidyny są słabymi zasadami i tworzą krystaliczne sole typu oksoniowego, tzw. benzopirylium lub flawylium.

Część cukrowa zazwyczaj składa się z glukozy, rzadziej z galaktozy, bardzo rzadko z ramnozy, ksylozy lub arabinozy. Zwykle jest ona przyłączona przy C3. U diglikozydów lub triozydów cząsteczki cukrów są przyłączone przy C3, czasem przy C5 lub C7. Grupa hydroksylowa przy C4 jest zawsze wolna [2,14].

 

 

Rozpowszechnienie antocyjanów w świecie roślinnym

 

Jako barwniki kwiatów, owoców, często liści, łodyg, a także (rzadziej) korzeni lub drewna — są bardzo rozpowszechnione. Nie ma ich jedynie                u grzybów, glonów i bakterii. Występują powszechnie w postaci glikozydowej w roślinach kwiatowych, paprotnikach i mchach, z wyjątkiem rzędu Caryophyllales w klasie Dicotyledones; rząd ten charakteryzuje się innymi barwnikami zawierającymi azot — tzw. betalaninami.

W niektórych rodzinach botanicznych występują acetylowane antocyjany (Brassicaceae, Lamiaceae, Solanaceae, Iridaceae) lub połączenia antocyjanidyn z kwasem cynamonowym lub fenolokwasami.

Różnorodność występowania antocyjanów dotyczy głównie części cukrowej, dotychczas natomiast znanych jest tylko 15 aglikonów (antocyjanidyn), a liczba poznanych antocyjanów przekracza 300 [2,3].

   

Biogeneza

 

Biosynteza antocyjanów przebiega w sposób podobny do flawonoidów, tj. poprzez kwas szikimowy i choryzmowy, w jej wyniku tworzy się pierścień aromatyczny B oraz łańcuch trójwęglowy. Pierścień aromatyczny A formuje się z jednostek C3 aktywnego malonianu.

W końcowym etapie biosyntezy następuje glikozydacja i ewentualnie metylacja lub acetylacja grup hydroksylowych [2].

 

Właściwości fizykochemiczne

 

Antocyjany są stosunkowo trwałe w postaci glikozydów i to                   w środowisku lekko kwaśnym. Zwykle są ekstrahowane z surowca roślinnego lekko zakwaszonym metanolem. Wytrącają się również solami ołowiu. Wolne antocyjanidyny są nietrwałe i łatwo rozkładają się lub polimeryzują na świetle         i w obecności tlenu.

Zabarwienie antocyjanów w tkankach roślinnych zależy nie tylko od pH soku komórkowego, ale także od kompleksów metalicznych, jakie tworzą z metalami, tj. z Fe3+, A13+. Zazwyczaj w środowisku kwaśnym antocyjany mają barwę czerwoną, przechodzącą podczas alkalizacji w niebieską. Jednakże antocyjany mające wolne grupy hydroksylowe w pozycji 3' i 4' są zdolne do wytwarzania wyżej wspomnianych kompleksów z metalami, połączonych ponadto polimerami kwasu galakturonowego, które to kompleksy zachowują barwę niebieską nawet w środowisku słabo kwaśnym, np. antocyjany kwiatów chabru bławatka Centaurea cyanus (Asteraceae), ostróżeczki polnej Consolida regalis (Ranunculaceae) — cyjanina i delfina. Dopiero silne kwasy mogą rozłożyć te kompleksy, dając czerwone zabarwienie antocyjanów.

Obserwowana barwa kwiatów poszczególnych gatunków roślin jest wypadkową uzależnioną od występowania różnych antocyjanów lub ich kompleksów z metalami, a także innych barwników, takich jak flawony i karotenoidy.

Antocyjany są rozpuszczalne w wodzie. Barwa ich może być różowa, niebieska, fioletowa lub czerwona — w różnych odcieniach — zależy ona od ilości i rozmieszczenia grup hydroksylowych oraz ich ewentualnej metylacji, a także od budowy części cukrowej. Wykazują absorbancję w nadfiolecie w pasmach o długości fali 465-550 nm oraz około 275 nm (słabiej) [2,14].

 

Właściwości farmakologiczne, zastosowanie

Podobnie jak związki flawonowe antocyjany wykazują wpływ na przepusz­czalność ścian naczyń włosowatych. Mają przy tym właściwości przeciwzapalne, w związku z czym są stosowane w krwawieniach i zaburzeniach mikrokrążenia, szczególnie w oftalmologii.

Polepszając ukrwienie w obrębie tęczówki oka mają wpływać dodatnio na ostrość widzenia, zwłaszcza w złych warunkach oświetleniowych (ważne dla kierowców). W tym celu są stosowane w postaci preparatów czystych lub kojarzone są z barwnikami karotenowymi albo flawonowymi. Specjalnie czynne w tym zakresie są malwina i cyjanina [2,3].

Znaczenie farmakognostyczne

 

Antocyjany są często spotykane w surowcach farmakognostycznych, zwłaszcza w kwiatach — Flos i owocach — Fructus. Pomimo to w niektórych surowcach mają znaczenie ważniejszych związków czynnych:

Do takich surowców antocyjanowych można zaliczyć:

Fructus Sambuci           —    owoc bzu czarnego

Fructus Myrtilli              —    owoc borówki czernicy (częściowo)

Flos Cyani                            —       kwiat bławatka

Flos Malvae arboreae   —    kwiat malwy czarnej (częściowo).

Ponadto znane są preparaty farmaceutyczne zawierające jako składniki czynne antocyjany, stosowane w zaburzeniach krążenia w obrębie gałki ocznej, wytwarzane głównie z owoców borówki czernicy lub porzeczki czarnej.  Gatunek Hibiscus sabdariffa z rodziny Malvaceae zawiera w zmięśniałych działkach kielicha znaczną ilość antocyjanów i znany jest w niektórych krajach europejskich jako surowiec Flos Hibisci, służący do sporządzania orzeźwiającego napoju (Malvatee) [2].

Ważniejsze antocyjanidyny

1. Pelargonidyna — jedna z najczęściej występujących antocyjanidyn.  Ma intensywną barwę czerwoną. Nie tworzy kompleksów metalicznych z żela­zem i glinem z powodu braku grupy hydroksylowej w pozycji 3'. Szczególnie często spotykana jest w roślinach hodowanych.

2. Cyjanidyna — rozpowszechniona szczególnie w postaci glikozydu cyjaniny. Tworzy niebieskie kompleksy metaliczne nawet w środowisku lekko kwaśnym, np. w kwiatach bławatka Centaurea cyanus (Asteraceae).

3. Delfinidyna — bardzo rozpowszechniona, szczególnie w rodzinach Boraginaceae i Campanulaceae. Nie występuje w rodzinach Rosaceae i Papaveraceae.

4.  Malwidyna — występuje często, m.in. w rodzaju Malva (Malvaceae).

5.  Peonidyna i petunidyna — należą również do częściej spotykanych aglikonów (antocyjanidyn) [2,3].

 

1.4. Metody oznaczania jakościowego i ilościowego flawonoidów

Identyfikację wyizolowanych związków prowadzi się metodami chemicznymi (reakcje barwne, badanie produktów hydrolizy), spektralnymi (UV, 1 H NMR, 13 C NMR, IR, MS).

Szerokie zastosowanie w badaniach glikozydów flawonoidowych i produktów hydrolizy znalazła chromatografia: na płaszczyznach - chromatografia bibułowa i cienkowarstwowa, kolumnach - chromatografia cieczowa i gazowa. Chromatografia pozwala nie tylko na stwierdzenie obecności związku w surowcu, lecz także na wnioskowanie o jego zawartości. Stosunkowo dobre zróżnicowanie glikozydów flawonoidowych ze względu na rodzaj i liczbę cząsteczek cukru oraz ich lokalizację, otrzymuje się używając w chromatografii cienkowarstwowej jako adsorbentu: poliamidu, żelu krzemionkowego G, tlenku glinu i innych. Najczęściej stosuje się gotowe płytki chromatograficzne, ich charakterystyka jest podana na opakowaniu. Zasadnicze znaczenie dla dobrego rozdziału związków flawonoidowych ma dobór odpowiedniej fazy ruchomej i adsorbenta. W skład fazy ruchomej wchodzą najczęściej następujące rozpusz­czalniki: woda, kwas octowy o różnych stężeniach, n-butanol, octan etylu, kwas mrówkowy, benzen, keton metyloetylowy, chloroform, aceton. Rozdzielanie substancji na cienkich warstwach wykonuje się niekiedy wielokrotnie, rozwijając chromatogram w tej samej lub różnych fazach ruchomych. Stosując tę samą fazę ruchomą, często stosuje się proces ciągły lub rozwijanie dwukierunkowe. Ostatnio do oznaczania kwercetyny w wyciągu z kwiatu bzu czarnego zastosowano izotachoforezę kapilarną, polegającą na sprzężeniu kolumny z oznaczeniem konduktometrycznym, dzięki czemu odzysk flawonoidu był w granicach 95-98% [15,16]. Do badania tożsamości związków stosuje się wzorzec substancji o znanej wartości Rf. Po dokonaniu rozdziału na cienkiej warstwie można zlokalizowaną substancję wyeluować odpowied­nim rozpuszczalnikiem  i oznaczyć ilościowo właściwą metodą. W chromatografii cieczowej wysokosprawnej fazą ruchomą jest ciecz przepływająca pod wysokim ciśnieniem poprzez warstwę złoża w kolumnie. Identyfikację i oznaczanie składników umożliwiają detektory reagujące na zmiany zachodzące w składzie fazy ruchomej podczas wymywania z kolumny składników mieszanin. Wybór rozpuszczalników zależy od właściwości badanego flawonoidu i stosowanego układu detekcyjnego, niekiedy stosuje się fazę ruchomą, o składzie zmieniającym się podczas procesu chromatograficznego (elucja gradientowa). Fazy ruchome w chromatografii cieczowej, w odróżnieniu od chromatografii gazowej, są ważnym elementem zmiennym, dostarczającym wielu możliwości doboru najkorzystniejszych warunków rozdziału. Sposób postępowania podczas identyfikacji i oznaczania w chromatografii cieczowej jest zbliżony do przyjętego w chromatografii gazowej, ale w przypadku objętości próbek większych niż 10 mm3 nie jest konieczne stosowanie wzorców wewnętrznych, gdyż technika ich wprowadzania na kolumnę pozwala na uzyskanie dostatecznej powtarzalności.

W chromatografii gazowej fazą ruchomą jest gaz. Badania jakościowe prowadzi się na podstawie porównania czasu retencji, retencji względnej substancji badanej i wzorcowej. Do oznaczania zawartości stosuje się najczęściej metodę wzorca wewnętrznego, która eliminuje błędy przy wprowadzaniu próbki na kolumnę. Najprostszą i znaną od dawna metodą do wykrywania flawonoidów jest fluorescencja w świetle UV. Intensywność promieniowania można zmierzyć w densytometrze i obliczyć zawartość związku w porównaniu z substancją wzorcową, badaną w tych samych warunkach chromatograficznych. Na chromatogramach widoczne są w postaci plam o fluorescencji żółtej - flawonole, izoflawony lub aurony, natomiast chalkony, flawony i ich glikozydy oraz glikozydy flawonolowe charakteryzują plamy o fluorescencji brunatnej. Niektóre odczynniki zasadowe jak pary amoniaku pogłębiają fluoresccncję żółtą, a brunatną zmieniają na żółtą.

Inną, bardzo ważną właściwością wykorzystywaną w oznaczeniach jakościowych i ilościowych jest zdolność tworzenia połączeń chelatowych hydroksylowych pochodnych flawonów i flawanonów z solami metali.

Największe zdolności kompleksotwórcze wykazują flawonoidy, które mają grupy hydroksylowe przy węglu 3, 5, 3', 4'. Najtrwalsze kompleksy powstają z udziałem tlenu karbonylowego i tlenu fenolanowego przy węglu C3 flawonu. Takie flawony jak kwercetyna (3, 3', 4', 5, 7-pentahydroksyflawon) i moryna (2', 3, 4', 5, 7- pentahydroksyflawon) znalazły zastosowania  w analizie chemicznej do fotometrycznych, ekstrakcyjno-fotometrycznych i fluorymetrycznych oznaczeń stężeń takich jonów nieorganicznych jak: glinu, żelaza, molibdenu, antymonu, talu, wanadu [17]. Ostatnio wykorzystano kwas kwercetyno-5'-sulfonowy do spektrofotometrycznego oznaczania lantanowców [18]. Najczęściej stosowana jest reakcja flawonoidów z chlorkiem glinowym (1% roztwór alkoholowy), powstaje kompleks o barwie żółtej w świetle widzialnym, a w świetle UV o żółtozielonej fluorescencji. Nie specyficzna jest reakcja z chlorkiem żelazowym (1% roztwór metanolowy), gdyż daje on zabarwienie zielone, brązowe lub brunatno-czerwone nie tylko z flawonoidami, ale też z innymi związkami o charakterze fenoli. Specyficzna jest reakcja  z tlenochlorkiem cyrkonu (2% roztwór metanolowy), który powoduje żółte zabarwienie flawonoidów zawierających wolne grupy hydroksylowe przy węglu 3 i 5. Stosunkowo rzadziej stosowana jest reakcja kompleksowania flawonoidów z trójchlorkiem lub pięciochlorkiem antymonu (10% roztwory chloroformowe), barwa powstałego kompleksu jest od żółtej do czerwonej. Flawony od flawanonów można odróżnić poprzez reakcję z octanem magnezu (1% roztwór metanolowy), kompleks z flawonem ma barwę żółtą,  a z flawanonami w świetle wykazuje intensywną błękitną fluorescencję. Reakcją specyficzną dla flawonoidów zawierających wiązanie podwójne między węglem 2 i 3 jest reakcja z kwasem borowym, który w obecności kwasu szczawiowego daje żółty kompleks z flawonami (3% kwas borowy i 10% kwas szczawiowy w stosunku 3:1) [16].

Do ilościowego oznaczania związków flawonoidowych najczęściej stosuje się metody spektrofotometryczne, kolorymetryczne i polarograficzne. Metody polarograficzne i spektrofotometryczne są przydatne do oznaczania czystych substancji. Metodami kolory­metrycznymi można oznaczać zawartość flawonoidów w wyciągu po jego wstępnym oczyszczeniu. Zawartość flawonoidów oznacza się z pomiaru natężenia zabarwienia powstałego  w wyniku reakcji flawonoidu z trójchlorkiem antymonu, tlenochlorkiem cyrkonu, octanem uranylowym, azotanem berylu, kwasem borowym lub chlorkiem glinowym (w metodzie Christa-Műllera). W metodzie Horaka wykorzystuje się reakcję sprzęgania hydroksyflawonu z dwuazowanym kwasem sulfanilowym, w wyniku której powstaje barwny związek azowy [19].  W oznaczeniach ilościowych wykorzystuje się także intensywność barwy kompleksu flawonoidu z kwasem p-aminobenzoesowym np. w preparacie aerozolowym Sanofil i w herbamiodach: gryczanym i jarzębinowym; wzorcem do sporządzenia krzywej wzorcowej jest kwercetyna.

Inny kompleks barwny tworzą flawonoidy z odczynnikiem Folina-Ciocalteu'a (mieszanina wolframianu sodowego, molibdenianu sodowego, siarczanu litu w środowisku kwasu fosforowego i solnego) np. w oznaczeniu zawartości rutozydu w wikalinie [20].

Osobną grupę stanowią metody oparte na oznaczaniu produktów redukcji flawonoidów. Polegają one na redukcji flawonoidów do antocyjanów wodorem in statu nascendi, a następnie pomiarze intensywności powstałego zabarwienia. Redukcję przeprowadza się w środowisku kwaśnym w obecności magnezu lub cynku, albo w środowisku alkalicznym w obecności amalgamatu sodu. Czułość metody można zwiększyć stosując cynk i azotyn sodowy, który pogłębia barwę.

Do sporządzenia krzywej wzorcowej wybierany jest związek flawonoidowy, który najliczniej występuje w surowcu i tworzy najtrwalsze połączenia. Dla flawonoli jest to najczęściej rutozyd (3-glukoramnoglukozyd kwercetyny), hiperozyd (3-galaktozyd kwercetyny), kwercetyna - 3, 3', 4', 5, 7- pentahydroksyflawon (w oznaczeniach po hydrolizie), dla flawonów - luteolina (3', 4', 5, 7-tetrahydroksyflawon), dla flawanonów - hesperetyna (4'-metoksy, 3', 5, 7-trihydroksyflawanon).

Metoda Horaka może służyć do oznaczania sumy flawonoidów, jak  i poszczególnych związków, ponieważ oznaczenie ilościowe poprzedzone jest rozdziałem flawonoidów metodą chromatograficzną. Jest to metoda czuła, ale pomiary absorbancji muszą być wykonywane bezpośrednio po utworzeniu barwnego związku azowego, ponadto można nią oznaczać zarówno glikozydy jak i aglikony. Metodę Horaka zastosowano do oznaczania zawartości flawonoidów w liściu brzozy Folium Betulae - substancją wzorcową jest hiperozyd, w kwiatach bzu czarnego Flos Sambucus nigra - wzorcem jest rutozyd, w zielu skrzypu Herba Equisetum arvense — wzorcem jest hiperozyd lub izokwercetyna (3-glukozyd kwercetyny), w zielu połonicznika - wzorcem jest rutozyd lub 3-ramnoglukozyd izoramnetyny, w zielu dziurawca Herba Hyperici - wzorcem jest hiperozyd, w zielu rdestu ptasiego Polygonum aviculare - wzorcem jest hiperozyd lub awikularyna (3-arabinozyd kwercetyny),  w kwiatostanie głogu Inflorescentia Crataegi — wzorcem jest 4'-ramnozyd witeksyny lub hiperozyd, w kwiatostanie kocanki Inflorescentia Helichrysum arenarium - wzorcem jest 5-diglukozyd naryngeniny lub astragaliny  (3-glukozyd kemferolu) [16].

Metoda Christa-Műllera służy do oznaczania flawonoli, gdyż flawonoidy ekstrahuje się z surowca kolejno acetonem, octanem etylu w środowisku kwaśnym, przez co glikozydy łatwo hydrolizują. Metoda ta jest stosowana do oznaczania flawonoidów w liściach brzozy, w kwiatach bzu czarnego, w zielu dziurawca, w zielu rdestu ptasiego, w propolisie,  w Azucalenie, w tabletkach dopochwowych Calendulin, w Betasolu - wzorcem oznaczenia jest kwercetyna, w zielu skrzypu — wzorcem jest kwercetyna lub kemferol, w zielu połonicznika - wzorcem jest kwercetyna lub izoramnetyna,   w kwiatostanie głogu - wzorcem jest kwercetyna lub witeksyna, w kwiatostanie kocanki - wzorcem jest naryngenina lub kemferol [16,21].

Farmakopea Polska V podaje tylko dla rutyny, dwóch preparatów galenowych (krople nasercowe i krople nasercowe z wyciągiem z zarodków koła) i trzech mieszanek ziołowych (zioła przeciwgorączkowe, przeciwreumatyczne i metaboliczne) wymagania jakościowe i ilościowe dla zawartych flawonoidów. W monografii szczegółowej podany jest dokładny opis metody chromatografii cienkowarstwowej stosowanej do badania tożsamości, wraz ze schematem chromatogramu wyciągu z określonego preparatu, oraz przepis oznaczenia zawartości metodą spektrofotometryczną w oparciu  o tworzenie barwnego kompleksu flawonoidu z chlorkiem glinowym [22,23].

Do najważniejszych tendencji jakie można zaobserwować analizując inne farmakopee, takie jak Farmakopeę Europejską, Farmakopeę Amerykańską, Farmakopeę Brytyjską, należy zaliczyć przede wszystkim stałe podwyższanie wymogów dotyczących czystości surowców farmaceutycznych, co uwidacznia się w określaniu szczegółowych limitów obecności substancji czynnych  i zanieczyszczeń oraz zastępo­waniem starych technik nowymi np. badanie metodą HPLC z zastosowaniem izokratycznej (o stałym składzie) fazy ruchomej, co jest techniką mniej skomplikowaną niż elucja gradientowa. Szczególnie duży nacisk położono na szczegółową identyfikację składników w produktach pochodzenia naturalnego (zwłaszcza w surowcach roślinnych i ich produktach pochodnych), co jest widoczne w nowych monografiach Suplementu 2000 Farmakopei Europejskiej (PhEur III) dzięki zastosowaniu odpowiednich metod chromatogra­ficznych. Jako przykłady mogą służyć monografie kwiatostanu głogu Crataegi folium cum flore, ziela męczennicy Passiflorae herba. Badania wykonuje się metodą chromatografii cienkowarstwowej  z użyciem hiperozydu jako substancji porównawczej w przypadku badania ziela męczennicy, w przypadku badania kwiatostanu głogu z użyciem hiperozydu  i rutyny jako substancji porównawczych. Równocześnie w mono­grafiach kwiatostanu głogu i ziela męczennicy zawarty jest wymóg dotyczący ogólnej zawartości flawonoidów, wynoszący w obu przypadkach 1,5%, oznaczenie wykonuje się metodą kolorymetryczną. W Farmakopei Amerykańskiej 2000 (USP 24/NF 19), w monografii liścia miłorzębu zawartość glikozydów flawonowych powinno wynosić minimum 0,8%, w monografii rumianku wymaganie dotyczące zawartości 7-glikozydu apigeniny - minimum 0,3%, a w monografii ziela dziurawca wymagania dotyczące zawartości hiperycyn - minimum 0,04%, przy czym w wielu monografiach substancji roślinnych badanie zawartości substancji czynnych wykonywane jest metodą HPLC [24]. Do flawonoidów zaliczane są także proantocyjanidyny, rozdział i identyfikacja produktów tiolizy tych związków przeprowadzana jest najczęściej metodą HPLC. Stosowane są trzy metody kolorymetryczne do oznaczania ogólnej zawartości tych związków: Swaina i Hillisa [25] - oparta na reakcji barwnej flawanoli z waniliną w silnie kwaśnym środowisku w obecności kwasu solnego lub siarkowego, metoda Putmana i Butlera [26], oparta na reakcji flawanoli z aldehydem dimetyloaminocynamonowym oraz metoda Per i Pompei [27] polegająca na degradacji bezbarwnych proantocyjanidyn, ogrzewanych w silnie kwaśnym środowisku, do czerwono zabarwionych antocyjanidyn.

 

       1.5. Glycyrrhiza glabra L. – lukrecja gładka

Rodzina Leguminosae (Fabaceae) – Motylkowate

 

1.5.1. Znaczenie historyczne

 

Lukrecja znana była już w Helladzie i Rzymie – piszą o niej Hipokrates,  Teofrast, Dioskorydes, Pliniusz, Celsus, Scribonius Largus i in. W Indiach znana była od starożytności i ceniona jako lubczyk. W wywarze z korzeni kąpie się tam dotąd posągi Buddy w dniu jego urodzin (ósmego dnia, w ósmym miesiącu) lub też polewa się nim, krople spływające przy tym z posągu zbiera się na lekarstwo [28]. Lukrecję spotykamy także w papirusie Ebersa, była więc stosowana VI wieku p.n.e. w starożytnym Egipcie, wspomina ją Conrad  von Megenberg w XV w.n.e., Leonard Fuchs (1543), Hieronymus Bock (1577), Tabernemontanus (1731) i wszyscy oni są zgodni co do wysokich walorów leczniczych tej rośliny [29].  Ceniona jest jako lek w Mongolii. Większe uprawy w Italii założono dopiero w wieku XIII, także w Anglii dopiero od roku 1264. W Niemczech pierwszy zainteresował się lukrecją C. v. Megenberg w wieku XIV, później zielarze średniowieczni. Duże uprawy w okolicy Bambergu założono w wieku XV. W wieku XVII próbowano cukier z trzciny cukrowej zastąpić cukrem z lukrecji, jednakże bez powodzenia [28].

 

1.5.2. Roślina macierzysta

 

Lukrecja gładka jest byliną, do 1 m wysoką. Liście ma nieparzystopierzaste, kwiaty fioletowe zebrane w grona. Owocem jest gładki strąk. Podziemne narządy składają się z korzeni i rozłogów, 20-100 cm długości,  do 4 cm grubości. Lukrecja w stanie naturalnym występuje w Azji i południowej Europie, w Polsce bywa uprawiana. Zbiór surowca odbywa się z roślin uprawianych [30].

 

1.5.3. Pochodzenie i występowanie

 

Surowiec farmaceutyczny stanowią płytko okorowane korzenie i rozłogi Glycyrrhiza glabra Linne, z rodziny Leguminosae (Fabaceae), podrodziny Papilionatae. Roślina ta znana jest w różnych odmianach.

Glycyrrhiza glabra varietas typica Regel et Herder o łodydze gładkiej i błękitnych kwiatach pochodzi z Azji Mniejszej i Europy południowej.

Glycyrrhiza glabra varietas glandulifera Regel et Herder z gruczołowato owłosionymi łodygami i liśćmi w stanie dzikim spotykana jest w Rosji, w okręgach centralnych i południowych, w Turcji i Iranie.

Glycyrrhiza glabra varietas violacea Boissier, o kwiatach fioletowych pochodzi z Iraku. Wymaganiom farmakopealnym mogą odpowiadać jedynie korzenie Glycyrrhiza glabra varietas glandulifera i ewentualnie Glycyrrhiza uralensis.

Varietas typica jest powszechnie uprawiana celem uzyskania surowca we Włoszech, na Sycyli, w Hiszpanii i Francji, a varietas glandulifera głównie w Rosji, szczególnie w dorzeczu dolnej Wołgi oraz w małych ilościach na terenie Niemiec. Plantacje mnoży się z rozłogów, przy czym zbiór następuje w 3-4 roku. Większość jednak surowca pochodzi z roślin dziko rosnących w Rosji, w dorzeczu Uralu oraz w Azji Mniejszej, Mezopotamii i Włoszech. W Polsce uprawa jest rozpoczęta, ale jeszcze na bardzo małą skalę [31].

 

1.5.4. Otrzymywanie

 

Surowiec zbiera się na jesień lub wczesną wiosną i po okorowaniu suszy. W handlu znajduje się wiele gatunków lukrecji: okoronowany, nieokorowany, podwójnie okorowany. Ponadto wyróżnia się gatunki handlowe według pochodzenia, przy czym surowce hiszpańskie są twardsze i cięższe, toną w wodzie, rosyjskie zaś - lżejsze, utrzymują się na powierzchni wody. We Włoszech niemal cały surowiec jest przerabiany na Extr. Glycyrrhizae crudum (tzw. Succus Liquiritiae), nie jest eksportowany [31].

 

1.5.5. Wymagania

 

Ocena wartości surowca nie jest jeszcze ustalona, gdyż ważnymi składnikami są zarówno związki flawonoidowe, jak i glicyryzyna.

Zawartość wilgoci do 11%, popiołu do 8,5%. Surowiec może zawierać jedynie do 8% korzeni i rozłogów niedokładnie okoronowanych oraz ściemniałych. Zniszczeń organicznych oraz mineralnych łącznie nie więcej niż 0,3% [31].

 

1.5.6. Substancje biologicznie czynne

 

Surowiec zawiera 2,5-4% glicyryzyny (czystej), czyli kwasu glicyryzynowego, który w surowcu występuje w związkach wapniowych i potasowych. Glicyryzyna należy do grupy saponin, choć ściśle saponiną nie jest; hemolizuje słabo czerwone krwinki, jej roztwory wodne silnie się pienią; przyjmowana doustnie jest całkowicie nietoksyczna. Glicyryzyna działa wykrztuśne i moczopędnie, warunkując też słodki smak surowca (jest około  50-krotnie słodsza od cukru). Jest to glukozyd triterpenowy hydrolizujący do kwasu glicyretynowego i dwu cząsteczek kwasu glukuronowego. Drugim składnikiem triterpenowym korzeni jest kwas glabrykowy (18-a-hydroksyglicyretynowy).

Ponadto w surowcu występują glukozyd flawanonowy likwirytyna, rozpadający się na likwirytygeninę i glukozę, izolikwirytyna (chalkon poprzedniego), formononetyna (izoflawon), po 3% goryczy – rozpuszczalnej w wodzie i nierozpuszczalnej, związki żywicowe do 4%, węglowodany jak        D-glukoza, sacharoza, mannitol i skrobia, bardzo małe ilości olejku lotnego zawierającego salicylan metylu, asparagina, związki lipidowe b-sytosterol i 22,23-dihydrostygmasterol, glabryna i kwas likworowy, dalej kwas jabłkowy, ślady tłuszczu i mało związków garbnikowych [31,33].

 

1.5.7. Zastosowanie

 

Korzeń (Radix Glycyrrhizae) działa moczopędnie, wykrztuśnie, likwiduje stany zapalne, stosuje się więc odwar przy przeziębieniach, chrypce, suchym kaszlu, jak i zaflegmieniu dróg oddechowych, reumatyzmie, ischiasie, gorączce, nieżytach, kurczach, wzdęciach, nerwicy żołądka i wątroby, przy kamicy moczowej, żółciowej, bólach nerek i wątroby o charakterze kolki, przy kolce jelitowej i zaparciu, po zakażeniu tężcowym i podobnych stanach zakaźnych oraz w chorobie Addisona [29,33].

Surowiec przeważnie stosuje się w schorzeniach dróg oddechowych, przy suchym kaszlu i chrypce, jako corrigens smaku, a rzadziej jako remedium diureticum spasmolyticum. Działanie rozkurczające warunkują obecne związki flawonoidowe. Po drugiej wojnie światowej surowiec znalazł zastosowanie w leczeniu choroby wrzodowej, przy nie krwawiących wrzodach żołądka oraz dwunastnicy.

Pewna bowiem frakcja z wyciągu surowca hamuje czynność wydzielniczą żołądka i obniża objętość soku żołądkowego, nie wpływając na stężenie kwasu solnego i aktywność enzymatyczną. W tym przypadku składnik czynny jest nie rozpoznany. Niezależnie od tego wyciąg kompleksowy przy podaniu per os wywiera wpływ na gojenie eksperymentalnych ran, skóry, analogiczny do działania dezoksykortykosterydów [31]. Pomocny jest również w leczeniu stanów zapalnych jamy ustnej, dziąseł i próchnicy zębów. Badania potwierdzają skuteczność działania cytostatycznego i przeciwnowotworowego, w przypadku wrzodów żołądka i dwunastnicy. Wyciągi te pobudzają mechanizmy obronne człowieka. W leczeniu alergii pokarmowych wykorzystuje się właściwości przeciwuczuleniowe lukrecji.

Niezwykle pomocne są wyciągi z lukrecji w schorzeniach dróg moczowych. Podczas stosowania preparatów z lukrecji należy jednak zachować ostrożność. Słodka lukrecja jest niewskazana dla osób z nadciśnieniem tętniczym, ponieważ zatrzymuje wodę w ustroju i wypłukuje potas. U kobiet        z zespołem napięcia przedmiesiączkowego powoduje wzdęcia.

Przemysł kosmetyczny natomiast wykorzystuje właściwość zatrzymywania wody w organizmie, a ściśle mówiąc w skórze. Przez nagromadzenie wody, zwłaszcza w skórze dojrzałej, uzyskuje się wspaniałe głębokie nawilżenie i odżywienie tkanek. Skóra twarzy staje się gładka, elastyczna i przede wszystkim zdrowa. Działanie to jest tym bardziej wskazane, iż szybkie życie zwłaszcza w dużych aglomeracjach powoduje, że jesteśmy w ciągłym napięciu i stresie. Skóra jest wspaniałym wskaźnikiem naszego stanu zdrowia. Należy więc z dużym uznaniem odnotować wyprodukowany przez firmę A.T.W w serii ANTYSTRES – odprężający tonik z wyciągiem z lukrecji, bardzo poprawiający wygląd skóry. Zapewne w przyszłości lukrecja wejdzie w skład innych kosmetyków „poprawiających” naszą urodę [32].

Najczęściej surowiec bywa stosowany w postaci ziółek, np. Species Altthaeae i proszków złożonych, jak Pulvis gummosus, Pulvis pectoralis, Pulvis Liquiritiae compositus, oraz w postaci Mel Symphyti, syropu, wyciągów i wysuszonego soku [31].

Przetwory lukrecji: Extractum Glycyrrhizae depur., Elixir Glycyrrhizae, Uldenol, Ulventrol, Azarina, Herbogastrin i Tussipect [29].


Łódz, 2002

EMAIL

MAGISTER 2000 (c)